تفاوت اثرات ضد میکروبی بالقوه سه گونه از گانودرما

چکیده: جهت بررسی تفاوت گونه های گانودرما ، اندام زایشی سه گونه از گانودرما با نام های گانودرما لوسیدوم (G. lucidum)، گانودرما اپلاناتوم (G. applanatum) و گانودرما استرال (G. australe) تهیه شد. اثرات آنتاگونیستی عصاره های اتانولی، متانولی و آبی این قارچ ها علیه میکروارگانیسم های بیماری زا بررسی شد. عصاره های خام این گونه های گانودرما اثرات مهاری متفاوتی علیه میکروارگانیسم های مورد مطالعه از خود نشان دادند. وسیع ترین قطر هاله عدم رشد از عصاره متانولی گانودرما لوسیدوم علیه باکتری پروتئوس میرابیلیس به دست آمد و همینطور بیشترین ویژگی ضد قارچی نیز از عصاره اتانولی خام گانودرما لوسیدوم علیه آسپرژیلوس نیجر مشاهده شد. کمترین قطر هاله عدم رشد از عصاره آبی گانودرما استرال علیه باکتری اشریشیاکلی حاصل شد در حالی که قطر هاله عدم رشد عصاره خالص گانودرما استرال در برابر قارچ پنی سیلیوم اگزالیوم ۲/۷ میلی متر بود. حداقل غلظت بازدارندگی عصاره اتانولی بین ۱/۷ تا ۵ میلی گرم/میلی لیتر برای باکتری ها و بین ۲ تا ۶ میلی گرم/میلی لیتر برای قارچ ها گزارش شده است. یافته های مورد مطالعه مورد بحث قرار گرفتند.

مقدمه

گونه های گانودرما جزو قارچ های بزرگ توجه قرار می گیرند زیرا کارپوفور های آن ها به اندازه کافی بزرگ هستند که با چشم غیر مسلح مشاهده شوند. اگرچه، اندامک واقعی از اجسام میکروسکوپی تشکیل شده که با چشم غیر مسلح قابل مشاهده نیست. آن ها تحت عنوان پلی پور هم نامیده می شوند زیرا دارای حفره های کوچکی زیر کلاهک هستند که حاوی اسپور های تولید مثلی می باشند. کلاهک آن ها زمانی که تازه باشند نرم و متخلخل بوده اما بعد از بلوغ ساختار درخشان و چوبی به خود می گیرند. رنگ کلاهک ها از قهوه ای تا زرد متغیر بوده در حالی که رنگ معمول پلی پور قهوه ای مایل به قرمز می باشد. سطح حفره ها به رنگ کرم بوده در حالی که اسپور ها قهوه ای هستند.

گونه های گانودرما متعلق به شاخه Basidiomycota، رده Homobasidiomycetes، راسته Aphyllophorales و خانواده Polyporaceae می باشد. آن ها جزو گونه های متعدد قارچ های تخریب کننده چوب به شمار می روند. گونه های گانودرما در دسته قارچ های خوراکی محسوب نمی شوند زیرا اندام زایشی آن ها همواره ضخیم و سفت بوده و دارای خصوصیات بافت گوشتی قارچ های خوراکی نمی باشند. اگرچه گونه های گانودرما مستقیم قابل مصرف نیستند اما در سراسر جهان به عنوان قارچ های دارویی شناخته می شوند. این قارچ ها به علت خواص دارویی گسترده خود، توجه زیادی در جهان به خود جلب کرده اند.

آن ها به دلیل ویژگی های ضد توموری، ضد سموم کبدی، ضد درد، محافظت از سیستم ایمنی، ضد باکتریایی و ضد ویروسی شناخته می شوند. Sheena و همکاران (۲۰۰۳) گزارش کردند متابولیت های ثانویه عمده گانودرما لوسیدوم شامل گانودریک اسید، تری ترپن ها و پلی ساکارید های کارسینواستاتیک می باشد. این ترکیبات زیستی فعال مسئول ویژگی های آنتی اکسیدانی، بهبود سیستم ایمنی و کاهش قند خون می باشند. در طول سه دهه گذشته، دانشمندان سراسر جهان بیش از ۱۵۰ تری ترپن و ۵۰ پلی ساکارید فعال دارویی از گونه های مختلف گانودرما جداسازی کردند.

در آفریقای غربی بویژه نیجریه، ادعا های زیادی مبنی بر تاثیر گونه های گانودرما بر سیستم ایمنی وجود دارد. گیاه شناسان گانودرما را به عنوان تعدیل کننده های طبیعی می شناسند بطوریکه اگر سیستم ایمنی بیش از حد فعال شود موجب سرکوب آن و باعث بهبود سیستم ایمنی در زمان فعالیت کم آن می شوند. پزشکان بومی جنوب غربی نیجریه ازگونه های گانودرما در درمان اختلالات پوستی، فشار خون بالا و مشکلات روده استفاده می کردند. آن ها معمولا گانودرما را به عنوان تقویت کننده سیستم ایمنی می شناختند بخصوص زمانی که با سایر اجزای دارویی ترکیب می شود. علی رغم استفاده های دارویی مهم گانودرما در نیجریه، اطلاعات در زمینه تاثیر آن ها بر باکتری ها و قارچ ها در مقالات بسیار ناچیز است. بنابراین هدف از این مطالعه بررسی اثرات مهارکنندگی این قارچ های دارویی مهم بر میکروارگانیسیم های بیماری زای خاص می باشد.

مواد و روش کار

قارچ ها و میکروارگانیسم های مورد آزمایش: سه گونه از گانودرما در این مطالعه مورد بررسی قرار گرفتند که شامل گانودرما لوسیدوم، گانودرما اپلاناتوم و گانودرما استرال می باشد. میکروارگانیسم های مورد مطالعه شامل اشریشیاکلی (Escherichia coli )، سودوموناس آئروژینوزا (Pseudomonas aeruginosa)، پروتئوس میرابیلیس (Proteus mirabilis)، کلبسیلا پنومونیه (Klebsiella pneumoniae )، استافیلوکوکوس اورئوسStaphylococcus aureus) )، باسیلوس سرئوس (Bacillus cereus)، پنی سیلیوم اگزالیوم (Penicillum oxalium)، پنی سیلیوم کریزوژنوم (Penicillum chrysogenum)، گونه های اکتینومیست (Actinomyces sp)، کاندیدا آلبیکانس (Candida albicans)، پاچه درماتیتیس (Pache dermatitis)، مالاسزیا اسلوفیا (Malassezia sloffiae)، مالاسزیا سیمپودیالیس (Malassezia sympodialis)، آسپرژیلوس نیجر (Aspergillus niger)، آسپرژیلوس فلاووس (Aspergillus flavus)، آسپرژیلوس تاماری (Aspergillus tamarri) و فوزاریوم اکسی پوروم (Fusarium oxyporum) می باشد. تمامی این میکروارگانیسم ها شناسایی و مشخص شدند.

ویژگی های ضد باکتریایی

این مطالعه با هدف بررسی ویژگی ضد باکتریایی گونه های گانودرما انجام شد. میکروارگانیسم ها درون محیط کشت از قبل کشت داده شدند و باکتری ها به مدت ۲۴ ساعت در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد و قارچ ها به مدت ۷۲ ساعت در دمای ۲۸ درجه سانتیگراد در گرمخانه قرار گرفتند. برای سنجش اثرات ضد باکتریایی عصاره های آبی، اتانولی و متانولی از روش های دیسک گذاری و چاهک گذاری طبق مطالعه Stoke  و Ridgway استفاده شد. در روش دیسک گذاری، از کاغذ صافی واتمن شماره ۱، دیسک هایی به ابعاد ۷ میلی متر تهیه شد. در فشار ۱/۰۲ کیلوگرم/سانتی متر مربع و دمای ۱۲۱ درجه سانتی گراد به مدت ۲۰ دقیقه اتوکلاو شده و سپس سرد شد. دیسک های کاغذی استریل به عصاره ها آغشته شده و به مدت ۱ ساعت در دمای ۴۰ درجه سانتیگراد قرار گرفته تا کاملا خشک گردید. هر دیسک در محیط کشت مولر هینتون آگار قرار گرفته و در انکوباتور سرد با دمای ۸ درجه سانتیگراد به مدت ۱۰ ساعت قرار داده شد تا میزان انتشار عصاره ها به محیط کشت افزایش یابد. پتری دیش ها به مدت ۲۴ ساعت در دمای ۲±۳۵ درجه سانتیگراد گرمخانه گذاری شدند. سپس قطر هاله عدم رشد اندازه گیری و ثبت شد و این عمل برای هر تیمار سه بار تکرار شد.

در روش انتشار از چاهک، از چوب پنبه سوراخ کن استریل برش هایی به قطر ۷ میلی متر برداشته و چاهک هایی در محیط کشت مولر هینتون آگار ایجاد کردیم. ۰/۲۵ میلی لیتر از عصاره ها به کمک پیپت پاستور استریل به داخل چاهک ها ریخته شد. برای مدتی صبر کردیم تا عصاره ها در محیط پخش گردد و از میکروارگانیسم های مورد آزمایش به محیط کشت تلقیح کردیم. بعد از ۲۴ ساعت گرمخانه گذاری، قطر هاله عدم رشد اندازه گیری و ثبت شد.

ویژگی های ضد قارچی

تعیین ویژگی های ضد قارچی این گونه های گانودرما به ترتیب با استفاده از قارچ های کاندیدا آلبیکانس، پاچه درماتیتیس، مالاسزیا اسلوفیا، مالاسزیا سیمپودیالیس، آسپرژیلوس نیجر، آسپرژیلوس فلاووس، آسپرژیلوس تاماری و فوزاریون اکسی پوروم صورت گرفت. محیط کشت سابوراد دکستروز آگار استریل طبق روش استاندارد تهیه شد. از چوب پنبه های سوراخ کن استریل ۵ میلی متری، چاهک هایی بر محیط کشت سابوراد دکستروز آگار ایجاد شد. با استفاده از پیپت پاستور استریل، ۲/۰ میلی لیتر از عصاره ها داخل چاهک ریخته و به مدت یک شبانه روز در یخچال قرار داده تا عصاره ها کاملا پخش شوند. سپس قارچ های مورد مطالعه را کشت داده و به مدت ۵-۳ روز در دمای ۲±۳۰ گرمخانه گذاری گردید. قطر هاله عدم رشد بر حسب میلی متر اندازه گیری شد.

حداقل غلظت بازدارندگی (MIC)

هدف از این مطالعه، تعیین حداقل غلظت آّبی، اتانولی و متانولی می باشد که مانع از رشد میکروارگانیسم های مورد آزمایش شود. غلظت های متفاوت عصاره از ۱۸-۱ میلی گرم/میلی لیتر تهیه شده و از روش انتشار از حفره استفاده گردید. از بالاترین غلظت عصاره ها تا کمترین غلظتی که هیچ هاله عدم رشدی مشاهده نشود، مورد بررسی قرار گرفتند. کمترین غلظتی (رقت) که هاله عدم رشدی در آن مشاهده نشود، تحت عنوان حداقل غلظت بازدارندگی نامیده می شود. به منظور اطمینان از دقت روش کار، هر آزمایش سه بار تکرار شده و سپس میانگین قطر هاله عدم رشد اندازه گیری شد. از آب مقطر استریل بدون عصاره گانودرما به عنوان کنترل استفاده گردید.

نتایج

نمودار ۱ نتایج عملکرد مهاری عصاره های سه گونه گانودرما علیه باکتری های مورد آزمایش نشان می دهد. مشاهده شد که هر سه گونه گانودرما سطوح مختلفی از فعالیت ضد باکتریایی از خود نشان دادند.

فعالیت ضد باکتری عصاره های اتانولی گونه های گانودرما

فعالیت ضد باکتری عصاره های متانولی گونه های گانودرما

فعالیت ضد باکتری عصاره های آبی گونه های گانودرما

فعالیت ضد قارچی عصاره های اتانولی گونه های گانودرما

هاله عدم رشد مناسبی توسط گانودرما لوسیدوم علیه باکتری های پروتئوس میرابیلیس، استافیلوکوکوس اورئوس و کلبسیلا پنومونیه ایجاد شد. کمتری اثر آنتاگونیستی عصاره اتانولی در گونه گانودرما اپلاناتوم علیه گونه های اکتینومیست مشاهده شده است.

نمودار ۲ فعالیت ضدباکتریایی عصاره های متانولی گونه های گانودرما را علیه باکتری های مورد آزمایش را نشان می دهد. عصاره خام گانودرما لوسیدوم بیشترین فعالیت ضد میکروبی را علیه کلبسیلا پنومونیه (۲۰/۳ میلی متر) نشان داده در حالیکه عصاره خام گانودرما اپلاناتوم علیه پروتئوس میرابیلیس (۱۹/۳ میلی متر) نشان داده شده است. هیچ هاله عدم رشدی از گونه گانودرما استرال علیه گونه های اکتینومیست مشاهده نشده است.

فعالیت ضد باکتریایی عصاره های آبی گونه های گانودرما در نمودار ۳ مشاهده می شود. در کل عصاره های آبی قارچ های مورد مطالعه فعالیت ضدباکتریایی پایین تری در مقایسه با عصاره های اتانولی و متانولی از خود نشان داده است. عصاره آبی خالص گانودرما لوسیدوم قطر هاله عدم رشدی برابر با ۱۵/۷ میلی متر علیه استافیلوکوکوس اورئوس از خود نشان داد.

نتایج ویژگی های ضد قارچی عصاره های گونه های گانودرما در نمودار ۴ آمده است. عصاره خام گانودرما لوسیدوم بیشترین قطر هاله عدم رشد (۲۴/۳ میلی متر) در برابر آسپرژیلوس نیجر از خود نشان داد.

فعالیت ضد قارچی عصاره های متانولی گونه های گانودرما

فعالیت ضد قارچی عصاره های آبی گونه های گانودرما

عصاره های گانودرما استرال کمترین اثرات ضد قارچی را علیه کاندیدا آلبیکانس از خود نشان دادند (نمودار ۴). پایین ترین فعالیت ضد قارچی به عصاره خام گانودرما استرال علیه پنی سیلیوم اگزالیوم تعلق دارد (۱/۷ میلی متر). تمام این نتایج در مقایسه با نمونه کنترل (آب مقطر) از لحاظ آماری معنی دار بودند.

در نمودار ۵، نتایج فعالیت آنتاگونیستی گونه های گانودرما علیه قارچ های مورد مطالعه آورده شده است. عصاره خام گانودرما لوسیدوم قطر هاله عدم رشدی برابر با ۲۱/۳ میلی متر به ترتیب علیه آسپرژیلوس تاماری و مالاسزیا سیمپودیالیس را ایجاد کردند. کمترین قطر مهاری مربوط به عصاره گانودرما استرال علیه پنی سیلیوم اگزالیوم بوده است.

مطابق نمودار ۶، بهترین قطر هاله عدم رشد (۲۲ میلی متر) توسط عصاره آبی خالص گانودرما لوسیدوم در برابر کاندیدا آلبیکانس تشکیل شده است. قطر هاله عدم رشد عصاره های آّبی خام گانودرما لوسیدوم و گانودرما اپلاناتوم در برابر کاندیدا آلبکانس و مالاسزیا اسلوفیا به ترتیب برابر با ۱۸/۷ و ۱۸/۳ میلی متر بود. مقادیر آن ها از لحاظ آماری تفاوت معناداری نداشت (P>0.05). به طور کلی، عصاره های آبی قطر هاله عدم رشد کمتری نسبت به عصاره های متانولی و اتانولی در مقابل تمامی قارچ های مورد مطالعه از خود نشان دادند.

حداقل غلظت بازدارندگی گونه های گانودرما علیه میکروارگانیسم های مورد آزمایش

نمودار ۷، نتایج حداقل غلظت بازدارندگی را نشان می دهد. کمترین غلظت بازدارندگی (۱/۷ میلی گرم/میلی لیتر) در عصاره خام گانودرما استرال در مقابل باکتری کلبسیلا پنومونیه مشاهده شده است. عصاره های خام گانودرما اپلاناتوم و گانودرما استرال با حداقل غلظت مهارکنندگی ۲/۳ میلی گرم/میلی لیتر علیه باکتری اشریشیاکلی در رتبه دوم قرار گرفتند.

بحث

در مطالعه حاضر مشاهده شد که هر سه گونه قارچ های گانودرما به نسبت های مختلف دارای فعالیت ضدمیکروبی بودند. همچنین نتایج این مطالعه تاییدی بر ادعای گیاه شناسان سنتی جنوب غرب نیجریه در زمینه ویژگی های درمانی گونه های گانودرما علیه عفونت های باکتریایی و قارچی انسان می باشد. Oei-2003 پیشنهاد داده که گونه های گانودرما بویژه گانودرما لوسیدوم می توانند به عنوان مکمل غذایی در برابر عفونت های میکروبی عمل کنند و موجب بهبود سیستم ایمنی انسان گردند.

مشاهده شده است که عصاره های مختلف گونه های گانودرما با توجه به حلال مورد استفاده برای استخراج، فعالیت ضدمیکروبی متفاوتی از خود نشان دادند. Jonathan و Fasidi-2003 بیان کردند که متابولیت های ثانویه فعال حاصل از قارچ ها، بسته به حلال مورد استفاده متفاوت می باشد که همسو با نتایج مطالعه حاضر می باشد. در میان حلال های مورد استفاده، آب عملکرد ضعیف تری از خود نشان داده است. همچنین، نتایج مطالعه Kawagishi و همکاران (۱۹۸۸) نشان داد که برخی از ترکیبات فیتوشیمیایی حلالیت بیشتری در الکل نسبت به آب داشته که با نتایج پژوهش حاضر مطابقت دارد. به دلیل ساختار مولکولی، اتانول حلال بهتری نسبت به متانول بوده است. تاثیر بیشتر اتانول به عنوان حلال می تواند به غلظت بالاتر ترکیبات استخراج شده مرتبط باشد. یافته های حاصل از مطالعه Fujita و همکاران (۲۰۰۵) نشان داد که اتانول حلال مناسب تری نسبت به متانول، و متانول حلال بهتری در مقایسه با آب می باشد که با نتایج این مطالعه مطابقت دارد. هر دو عصاره خام و خالص گونه های گانودرما ویژگی های ضدمیکروبی معنی داری را علیه اشریشیاکلی، سودوموناس آئروژینوزا، پروتئوس میرابیلیس، کلبسیلا پنومونیه، استافیلوکوکوس اورئوس، باسیلوس سرئوس و گونه های اکتینومیست نشان دادند. عصاره خام گانودرما استرال هیچ فعالیت ضدباکتریایی را در مقابل پروتئوس میرابیلیس و گونه های اکتینومیست نداشته است. نتایج مطالعه حاضر در محیط آزمایشگاهی بیانگر این موضوع بوده است که گونه های گانودرما می توانند در کنترل و درمان بیماری های باکتریایی تاثیر گذار باشند. علاوه بر این، عصاره های گانودرما لوسیدوم و گانودرما اپلاناتوم دارای اثرات ضدقارچی در مقابل پنی سیلیوم اگزالیوم، پنی سیلیوم کریزوژنوم، کاندیدا آلبیکانس، پاچه درماتیتیس، مالاسزیا اسلوفیا، مالاسزیا سیمپودیالیس، آسپرژیلوس نیجر، آسپرژیلوس فلاووس، آسپرژیلوس تاماری و فوزاریوم اکسی پوروم بوده در حالیکه عصاره گانودرما استرال هیچ فعالیت ضدقارچی علیه آسپرژیلوس نیجر، آسپرژیلوس تاماری، فوزاریوم اکسی پوروم و پنی سیلیوم کریزوژنوم مشاهده نشده است. گانودرما لوسیدوم با بیشترین قطر هاله عدم رشد در برابر آسپرژیلوس نیجر بیشترین تاثیر را داشته است. یافته های حاصل از این مطالعه، ادعای پزشکان سنتی جنوب غربی نیجریه را مبنی بر اثرات گانودرما لوسیدوم در درمان بیماری های پوستی در ترکیب با سایر افزودنی ها را تایید می کند.

مشاهده شده که غلظت های مختلف عصاره اتانولی این قارچ ها، موجب ظهور سطوح مهاری مختلفی شده است. می توان نتیجه گرفت غلظت عصاره ها نقش مهمی را در ویژگی ضد میکروبی قارچ های تکامل یافته تر ایفا می کند. در حالیکه برخی از عصاره قارچ ها در غلظت های بالاتر موجب مهار رشد میکروارگانیسم ها می شوند، در برخی قارچ های دیگر عکس این موضوع صدق می کند. Danieli-1957 اثبات کرد در پایین ترین غلظت بازدارندگی، عصاره ها همچنان قوی هستند زیرا متابولیت های ثانویه آزادانه در دسترس هستند و می توانند فعالیت آنتاگونیستی علیه میکروارگانیسم ها داشته باشند. بنابراین نیازی به استفاده از  غلظت های بالاتر که ممکن است خطر مسمومیت برای میزبان را هم به همراه داشته باشد، نیست.

بطور کلی در میان سه گونه گانودرما، گانودرما لوسیدوم بیشترین فعالیت آنتاگونیستی علیه میکروارگانیسم های مورد آزمایش داشته است. گانودرما اپلاناتوم در مرتبه بعدی و گانودرما استرال کمترین تاثیر را در میان این سه گونه به خود اختصاص داده است. نتایج این مطالعه اثبات می کند که گانودرما لوسیدوم یک گونه منحصر بفرد گانودرما می باشد که در درمان بیماری های مختلف کاربرد دارد.